下一个国自然热点预定！FFPE空间转录组4图拿下6分SCI

数据不会说谎，让我们用事实说话。大家好，我是小记者。最近小记者在pubmed冲浪时，发现近两年空转的文章激增，咱这就来看看是怎么个事。原来是空间转录组新测序技术取得了突破，这种科研圈大瓜怎么少得了小记者，这就带大伙们前来围观！

FFPE样本是病理标本长期保存的金标准，但制备过程中严重破坏核酸分子，增加了单细胞测序难度。近来新的测序技术突破了这些限制，使FFPE样本适用于空间转录组和单细胞测序研究。目前已有多项国家自然科学基金资助的相关研究，相信未来将有更多基于FFPE样本的单细胞研究项目涌现，FFPE样本即将迎来属于自己的“高光”时代。

今天小记者将带您一窥这篇探索FFPE空转样本适用性的文章，柏林健康研究所于2024年2月1日发表于《Cellular oncology》（IF 6.6）。下面先带大家细数本文的亮点吧：

1.探索并证明了FFPE样本在单细胞转录组分析中的适用性和稳健性，即使在长期保存的条件下也能保持较高的信息完整性。

2.FFPE样本的单细胞转录组能够与新鲜样本一样，准确地反映肿瘤的临床特征，如肿瘤分级、免疫细胞状态和PD-L1表达等。结果强调了单细胞分析在转化研究中的应用潜力，尤其是在利用历史临床样本进行生物标志物发现和疾病机制研究方面。（ps：FFPE样本通常和患者资料、疾病信息、用药及预后情况等临床数据相关联，是进行回顾性研究的不二之选。小记者持续给大家带来各种新鲜出炉且可复现的创新思路，如果手里有临床数据却不知如何开展生信分析或研究思路的，欢迎扫码找小记者交流哦。）

题目：新鲜和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺癌组织单细胞RNA谱中的临床相关特征可靠检测

杂志：Cellular oncology

影响因子：6.6

发表时间：2024.2.1      

研究背景

ScRNA-seq技术使得研究人员能够在单细胞水平上揭示肿瘤组织的复杂细胞组成，但受限于样本需要对新鲜或冷冻组织前瞻性收集，而许多重要的临床特征（如肿瘤遗传学、治疗反应和患者生存率）通常在样本获取后数周至数年才能获得，这限制了历史存档样本的单细胞分析。

数据来源

来自未经治疗的肺癌患者的新鲜、冷冻和FPE的肿瘤组织样本，共3例（P075、P078、P079）。

研究思路

这篇文章通过对来自同一患者的新鲜、冷冻和FFPE肺癌组织样本进行单细胞转录组测序（scRNA-seq），以评估FFPE样本在单细胞水平上检测临床相关特征的能力。内容包括样本的收集、处理、单细胞测序、数据分析、免疫组化验证以及统计分析，旨在比较不同样本处理方法在细胞类型、通路活性、基因表达等方面的一致性。

主要结果

1.新鲜、冷冻和存档FFPE样品的单细胞转录组的质量指标

研究者选择了三名肺腺癌患者的冷冻和FFPE组织样本（图1a）。新鲜和FFPE组织来源的文库显示出预期的高质量参数（图1b）。然而，从冷冻组织获得的结果在两轮文库制备和实验室工作流程优化后，质量得分不相等且较低。在所有患者中，新鲜组织样本检测到的基因数量最高，而FFPE或冷冻组织则较低（图1b）。尽管FFPE测序方法使用了受限的基因集，但新鲜、冷冻和FFPE样本的单细胞信息可以整合到一个共同的UMAP中，表明细胞类型信息在不同方法间是稳定的（图1c）。在确定主要细胞类型时，发现免疫细胞的转录组在新鲜组织单细胞文库中富集，而上皮细胞和基质细胞的转录组则相对减少，这表明组织解离可能对细胞代表性产生负面影响（图1d）。与最近发表的文献结果一致，解离压力的特征基因在新鲜组织转录组中最高，尤其是在上皮细胞（图1e）。

2.FFPE与新鲜样品中细胞类型丰度的比较

研究者随后整合了新鲜和FFPE数据这两种数据类型，以确定上皮细胞、免疫细胞和基质细胞的转录组比例（图2a）。与新鲜组织数据相比，FFPE数据能够更好概括IHC量化的主要细胞类型比例，但是两种数据都显示出免疫细胞的过表达，以及上皮细胞与基质细胞的欠表达（图2b）。上皮细胞Marker基因在新鲜和FFPE组织样本中展现出相似的表达得分，这些Marker基因包括EPCAM、KRT5、SCGB3A2、FOXJ1、AGER和SFTPC，它们分别标记了肿瘤上皮细胞、基底细胞、过渡细胞、纤毛细胞、AT1和AT2细胞（图2c）。此外，一些Marker基因优先检测新鲜样本与FFPE样本，这可能是由于新鲜与 FFPE 组织中上皮细胞转录组的绝对数量有不同，但也与患者 P078和 P079的 FFPE 组织块中上皮细胞类型多样性较高有关（图2d）。

免疫细胞Marker基因和细胞类型的检测在新鲜和FFPE组织样本中更为均匀（图2e, f），而在FFPE组织衍生的序列库中则检测到更多的成纤维细胞（图2g, h）。

3.FFPE与新鲜样品的细胞性状异质性

研究者比较了FFPE和新鲜样本在单细胞水平上细胞特征的异质性。样本制备技术的不同导致了新鲜组织和FFPE样本在个别基因表达水平上的差异，例如DUSP4在新鲜组织中表达更高，而KMT5A在FFPE样本中表达更高（图3a）。

但在通路活性和肿瘤相关细胞特征上，两者显示出高度相关性（图3b,c）。具体来说，成纤维细胞在TGFβ活性和间充质特征上得分高，增殖的T细胞和巨噬细胞在G2/M检查点和E2F靶标Hallmark签名上活性高，单核细胞和肿瘤相关的单核细胞衍生的巨噬细胞（Mo-Macs）在TNFα和NFκB信号通路以及干扰素γ反应Hallmark签名上得分高。整体上，新鲜和FFPE样本间的相关性非常强，皮尔逊相关系数大多大于0.9，显著性水平大多小于p = 0.001，表明可以从FFPE样本中推断出与新鲜样本相似的生物学相关的细胞类型特征。

4.FFPE与新鲜组织单细胞转录组的临床特征评估

研究者探讨了FFPE与新鲜组织样本的单细胞转录组是否能够同样程度地确定肿瘤和微环境特征的临床差异。肿瘤的组织学分级与最近发现的肿瘤分化特征基因完全相关（图4a,b）。在P079患者中，肿瘤组织学分级最低，与成纤维细胞中CAF相关通路的活性更高有关（图4c），并且高表达CAF Marker基因（图4d）。

肿瘤细胞中PD-L1的表达在组织学上有所不同，这种差异在新鲜和FFPE组织衍生的肿瘤上皮细胞转录组中也得到了验证（图4e,f）。

在P079患者中，肿瘤上皮细胞和肿瘤微环境中PD-L1高表达与干扰素γ反应Hallmark签名的高表达相关，尤其在Mo-Macs中（图4g,h）。此外，高PD-L1表达与CD4+ T细胞的低细胞毒性、高初始性得分以及CD8+ T细胞的高耗竭得分相关（图4i）。

文章小结

这篇文章通过对比分析来自同一肺腺癌患者的新鲜、冷冻和甲醛固定石蜡包埋组织样本的单细胞转录组数据，评估了FFPE样本在单细胞水平上检测临床相关特征的能力。发现FFPE样本在基因表达、细胞类型丰度、细胞特征异质性以及临床特征评估方面与新鲜样本具有高度相关性，表明FFPE样本能够可靠地用于单细胞分析，为临床研究和转化医学提供了新的可能性。

参考文献doi：10.1007/s13402-024-00922-0