国自然 | 新技术应用——细说CRISPR筛选

2024-09-12 基础科研 医学科研网
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关于国自然项目中，让专家“眼前一亮”的新技术中，我们已经介绍了多重免疫组化（mIHC）和类器官:

国自然预实验中，哪些技术让专家眼前一亮？——多重免疫组化（mIHC）

国自然热门技术，资助力大逐年增加，它就是——类器官！

今天我们继续介绍一个——CRISPR筛选。


在国自然中，当我们研究某个科研热点（如细胞铁死亡）或者某个临床问题（如肿瘤的免疫逃逸）时，一般都是通过组学获取差异基因、抑或通过数据分析基于相关性的原理进行初步筛选，从而得到一系列基因；如果想进一步进行研究，一般就要先验证基因表达，然后挑选基因挨个进行研究，这样带来的问题就是虽然基因表达是有差异的，但是细胞和动物水平的功能却不显著。而以CRISPR-Cas9基因敲除为代表的基因功能筛选，就可以通过批量筛选的方式，进一步对差异的基因进行功能筛选，从而大大缩小研究基因的范围。


实际上，在CRISPR-Cas9基因敲除技术筛选之前，以RNAi基因干扰为主要工具手段的基因共同筛选策略已有应用。由于CRISPR-Cas9技术的成功，以及在2020年获得诺贝尔化学奖，让CRISPR-Cas9技术大放异彩，而基于CRISPR-Cas9技术的筛选已经在各个研究领域得到广泛应用，也有非常多的高分文章。

下面我们将从CRISPR-Cas9技术筛选基本介绍、分类和案例和在国自然基金中的应用展开说明。


一、基本介绍

CRISPR-Cas9技术：CRISPR-Cas9技术是一种基于细菌免疫系统的突破性基因编辑工具，使用Cas9酶和指导RNA（sgRNA）来精确定位并剪切目标DNA序列。通过设计一段与目标基因互补的sgRNA，引导Cas9酶到DNA位置进行切割，一旦DNA被切割，细胞的修复机制会被激活，可以利用这一点通过提供修复模板来引导细胞进行基因的插入、删除或替换，实现基因编辑。 

简单来说，CRISPR筛选技术的原理：通过构建可敲除多个基因（如100个基因）的sgRNA和Cas9酶的病毒，进而病毒感染细胞，然后进行压力筛选（如化疗药物处理等），最后比较筛选前后哪些基因的敲除让细胞对压力更加耐受、或者敏感；从而获得对药物敏感或者耐药的基因。


二、CRISPR筛选的分类和案例

根据不同的分类标准，可以将CRISPR筛选进行以下分类：

1）根据CRISPR-Cas9技术对基因的干预影响，包括经典的基因敲除（KO）、激活（基于CRISPRa）和抑制（CRISPRi）等。
即经典的CRISPR-Cas9技术是将基因进行敲除；CRISPRa利用CRISPR-Cas9系统激活基因表达，通过将Cas9蛋白的DNA切割活性丧失（dCas9），并将其与转录激活子融合，从而增加特定基因的表达；CRISPRi类似于CRISPRa，但用于抑制基因表达，通过将dCas9与转录抑制子融合，阻止基因的转录。

  • 基因敲除案例

通过全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选发现LAPTM5是肝癌对靶向药仑伐替尼耐药的主因，该蛋白促进自噬溶酶体形成，增强自噬导致耐药。LAPTM5上调由DNA低甲基化和TP53突变引起，抑制自噬或敲除LAPTM5能增强仑伐替尼的抗癌效果，为治疗耐药肝癌提供新策略。

  • CRISPRa案例

利用全基因组CRISPR激活筛选技术在人类间充质前体细胞中找到抗衰老关键基因SOX5。SOX5通过激活HMGB2等抗衰老基因的转录网络，促进细胞年轻化。SOX5或HMGB2基因治疗能改善老年小鼠的软骨功能并缓解骨关节炎。

  • CRISPRi案例

通过CRISPR干扰（CRISPRi）筛选技术识别增强CAR T细胞对肿瘤杀伤效果的遗传修饰基因。在胶质母细胞瘤细胞的研究中，发现了多个关键因子，包括ARPC4、PI4KA、ATP6V1A、UBA1和NDUFV1，这些基因敲低后TNFSF15表达下调，增强了肿瘤与CAR T细胞的相互作用，提升了CAR T细胞的疗效。

2） 根据筛选的文库，包括全基因组文库、特定类型基因（如激酶）、特定类型分子（如lncRNA）等文库。

文库的选择取决于不同的研究目的，也各有优势。早期全基因文库用的比较多，近些年特定基因集的文库用的多一些，也商业化文库可以使用。当研究某个主题，如想筛选对铁死亡诱导剂耐药的药物靶点、对化疗药物耐药的潜在药物靶点等场景都可使用。

  • 全基因组文库案例

全基因组CRISPR/Cas9筛选在KRAS/STK11突变的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中进行，旨在发现增强KRASG12C抑制剂与SHP2抑制剂TNO155联合使用效果的基因；筛选识别出多个潜在的药物靶点；siRNA/shRNA实验验证了这些合成致死（SL）基因在体外和小鼠体内的作用。

  • 特定类型基因案例

利用CRISPR-Cas9全激酶组敲除筛选，研究者发现CK1α是克服恩杂鲁胺（ENZA）耐药性的治疗靶点；CK1α的缺失或药理学抑制增强了ENZA在耐药细胞和患者来源异种移植模型中的疗效；机制研究表明CK1α通过磷酸化丝氨酸残基S1270调节ATM蛋白丰度，ATM是DNA双链断裂响应信号的主要启动因子，在ENZA耐药细胞和患者中受损；抑制CK1α稳定ATM，恢复DNA损伤信号，从而增加ENZA诱导的细胞死亡和生长停滞。

  • 特定类型分子类型案例

通过全基因组CRISPR激活筛选在黑色素瘤细胞与人类CD8+ T细胞共培养中筛选了9744个长链非编码RNA（lncRNA），鉴定出16个可能调节肿瘤免疫反应的lncRNA；进一步整合肿瘤免疫基因组学数据分析发现，IL10RB-DT和LINC01198与黑色素瘤和乳腺癌的肿瘤免疫反应和生存显著相关；IL10RB-DT通过抑制IFN-γ-JAK-STAT1信号通路和抗原呈递来抑制CD8+ T细胞的激活；而LINC01198的上调则使肿瘤细胞对CD8+ T细胞的杀伤更敏感，其通过与NF-κB组分p65相互作用并激活，触发I型和II型干扰素反应。

3）根据研究的水平，大致分为：体外（in vitro）、体内（in vivo）和离体（ex vivo）等。

体外筛选主要以细胞系为在体，即关注基因对细胞生存、细胞死亡以及药物等条件压力下基因对细胞生存、细胞死亡等主题的影响；

体内筛选既包括体外细胞干预后体内回输后进行体内模型的筛选，也包括直接在动物模型进行的筛选。

离体（ex vivo）筛选主要指的是在类器官等平台进行的筛选。

  • 体外（in vitro）筛选案例

本研究通过CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选，在对SHP2抑制剂敏感的两株细胞中鉴定了SHP2抑制剂（SHP2i）耐药机制，发现了包括已知耐药基因和新靶点在内的多个基因；LZTR1、MAP4K5、SPRED2/STK40和INPPL1是导致SHP2i耐药的关键基因，它们的缺失可重新激活ERK信号通路；INPPL1的敏感性需要其NPXY结构域不依赖其脂质磷酸酶活性；LZTR1对RIT和RAS稳定性的影响具有细胞依赖性；这些基因的敲除在体内外均能导致SHP2i耐药。

  • 体内（in vivo）筛选案例

使用酪氨酸血症的Fah基因敲除模型进行了体内CRISPR筛选，鉴定了分泌型磷蛋白2（SPP2）作为调节肝脏再生的负向调控因子；SPP2缺失的小鼠在对乙酰氨基酚中毒和反复四氯化碳注射后的存活率提高，纤维化减少；研究发现SPP2在体外和体内均能拮抗骨形态发生蛋白信号通路；通过邻近生物素化结合质谱分析，研究者还鉴定了与SPP2相互作用的细胞表面受体，其中SPP2与整合素家族成员的相互作用部分负责了一些再生表型。

  • 离体（ex vivo）筛选案例

在原发性TP53-/-人类胃类器官中进行CRISPR/Cas9筛选，结果发现ARID1A基因敲除在TP53缺失的人类胃类器官中诱导了形态异常、肿瘤形成和粘液分化；ARID1A突变导致特定胃癌亚型的转录调控模块激活，包括与FOXM1和有丝分裂基因BIRC5相关的通路；高通量筛选发现ARID1A缺失的类器官对BIRC5抑制剂敏感，表明这一途径在ARID1A敲除依赖的胃癌形成中发挥关键作用。

4）根据检测指标的不同，可以分为细胞表型、特定基因表达等。

其中细胞表型主要包括细胞生存、细胞死亡等；而特定基因表达指的是筛选指标A的上游调控基因。

  • 细胞表型筛选案例

CRISPR/Cas9基因筛选用于鉴定与肝细胞癌（HCC）化疗相关的合成致死基因；研究发现磷脂酰丝氨酸tRNA激酶（PSTK）的抑制能增强HCC细胞对化疗的敏感性；PSTK与抑制化疗诱导的铁死亡有关，其缺失导致GPX4失活和谷胱甘肽代谢紊乱，从而增强了靶向化疗治疗中铁死亡的诱导；通过高通量虚拟筛选发现，治疗乙型肝炎病毒（HBV）的药物作为PSTK抑制剂，与索拉非尼联合应用在体外和体内治疗HCC时表现出协同效应。

  • 特定基因筛选案例

本研究通过30个基于荧光激活细胞排序（FACS）的全基因组CRISPR筛选，使用识别不同内源性DNA损伤信号蛋白的抗体，全面揭示了DNA损伤响应（DDR）信号通路的关键调控因子；研究发现蛋白酶体介导的加工是细胞触发喜树碱和依托泊苷诱导的DDR信号的早期且必需事件；此外，PRMT1和PRMT5被鉴定为调节ATM蛋白水平的调节因子；GNB1L作为共伴侣，通过特异调控PIKK蛋白，是DDR信号的关键调控因子。


三、国自然基金中的应用

在国自然项目申请中，一般我们确定要研究的基因比较多的方式有三种：一种是基于前期组学数据，比如通过转录组测序、单细胞测序等组学技术发现的差异基因，然后从差异基因中挑选到A基因进行研究；另外一种方式是生信分析，即通过数据挖掘的方式找到基因A，这种方式类似于第一种，本质上还是定量组学或者互作预测等方法；第三种方式是基于文献报道。


这次介绍的CRISPR筛选技术就给了一种新的方式：既可以通过全基因文库筛选的方式，直接发现功能上与热点表型、与临床问题相关的基因，也可以基于前期组学数据、生信分析等通过特定基因文库的CRISPR筛选方式对显著差异表达基因进行筛选，以进一步缩小基因范围，从而引出关键基因A。

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