国自然热点：表观遗传修饰网络构建——精氨酸甲基化
精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族蛋白及其介导的精氨酸甲基化修饰与癌症的发生发展密切相关。 精氨酸甲基化修饰分为单甲基化、对称性双甲基化和非对称性双甲基化修饰。PRMT主要有9个成员，依据其催化的精氨酸甲基化修饰分为I，II，III三型，其中I型包括PRMT1，2，3，4，6和8，能催化单甲基化和非对称双甲基化；II型包括PRMT5和9，能催化单甲基化和对称双甲基化；III型的PRMT7只能催化单甲基化。大量研究报道了I型和II型PRMT的甲基化修饰底物的鉴定，但唯一一个III型PRMT 成员PRMT7的底物及其与I型和II型PRMT的底物的关系仍是未知。
近日，厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室，厦门大学药学院刘文教授团队在Nature Communications（IF：16.6）杂志上发表论文“Profiling PRMT methylome reveals roles of hnRNPA1 arginine methylation in RNA splicing and cell growth”， 研究团队利用高分辨率质谱鉴定了细胞中PRMT7的精氨酸甲基化底物，并与PRMT4和PRMT5的底物进行了比较分析，后通过质粒转染、免疫沉淀、免疫荧光、选择性剪接等实验揭示了精氨酸甲基转移酶家族蛋白介导的精氨酸甲基化修饰网络及其协同调控基因剪接和促癌机制。
https://www.nature.com/articles/s41467-021-21963-1
主要内容 作者对HEK293细胞中PRMT7（唯一的III型PRMT）调节的精氨酸甲基化进行研究。PRMT7的敲除导致MMA显着减少，但aDMA或sDMA没有显着减少，表明PRMT7的主要活性是蛋白质中精氨酸残基的单甲基化（图1a）。另外检测了PRMT7的敲低效率（图1b），以及通过靶向PRMT7的siRNA特异性拯救实验证明野生型（WT）而不是酶死亡突变体（MT）PRMT7拯救了由PRMT7敲低引起的MMA水平的降低（图1c）。 将纯化的 PRMT7 与随机选择的 PRMT7 调节的甲基化蛋白混合进行体外甲基化测定，发现所有选定的蛋白质均在体外被 PRMT7 甲基化（图1g）。使用hnRNPA1突变体进行验证，通过将纯化的PRMT7蛋白与hnRNPA1（WT）或突变体混合进行体外甲基化实验。单个位点突变体减弱了PRMT7介导的甲基化，而所有（5个）精氨酸位点被替换的突变体减弱效果最显著（图1k）。 PRMT7调控的单甲基化肽中最富集的基序是GAR和RXR基序（图2a），且大多数底物蛋白含有一个以上的PRMT7调节的精氨酸甲基化位点，如TAF15蛋白中存在8个精氨酸甲基化位点受到PRMT7的调控（图2b），并且PRMT7调节的精氨酸甲基化位点大约34%至少有一个磷酸化位点在附近（图2c），其调节的精氨酸甲基化位点及其附近的突变频率显著更高，这些表明PRMT7调节的精氨酸甲基化可能具有重要功能（图2d，e）。 富集分析发现PRMT7甲基组主要富集了RNA生物学和染色体/染色质生物学的相关通路，主要集中在剪接体、mRNA监视、mRNA转录及单纯孢疹病毒感染（图2f，g）。 在PRMT4和PRMT5敲低实验中，分别预测了665个蛋白中1504个（1036个MMA和588个aDMA）甲基化位点和585个蛋白中1216个（1131个MMA和366个sDMA）甲基化位点。在所有的敲除实验中，发现301个蛋白中的660个位点的甲基化信号至少减少了两倍，这301个蛋白被称为“PRMT4甲基组”。“PRMT5甲基组”的定义类似，有244个蛋白携带429个PRMT5调节的精氨酸甲基化位点（图3a）。与之前的报道一致，PRMT5调控精氨酸甲基化的基序一致为GAR，而在PRMT4调控的精氨酸甲基化中发现了一个富含脯氨酸的基序。 鉴定了已知的PRMT4底物发现，KMT2D和DERPTC蛋白中有16个精氨酸甲基化位点受PRMT4调控，EIF4G1蛋白中有9个受PRMT5调控，并且它们附近的甲基化位点和序列容易受到癌症突变的影响（图3c-g）。与PRMT7类似，PRMT4和PRMT5甲基化组主要富集在RNA生物学和染色体/染色质生物途径，最富集的前四个通路是剪接体、mRNA监视、mRNA转录及单纯孢疹病毒感染（图3h-i）。 PRMT4、5和7的抑制导致其调节的2770、2741和2705选择性剪接事件发生显著变化（图4a，b）。在PRMT4、5和7共同调控的 444 个选择性剪接事件中，213个是外显子（图4c），这些共同调控的外显子，受到相同方向的调控，并在共同调控下发生了127个跳跃事件。PRMT7的敲低还进一步诱导了选择性剪接的变化，这表明 PRMT7 介导的单甲基化可能在 PRMT4、5和7共同调控的盒式外显子的调节中至关重要（图4）。 对PRMT4、5和7甲基化组进行了比较，发现62个蛋白质受到这三个PRMT的共同调控（图5a），这62种蛋白质高度富含剪接因子，特别是C复合剪接体和Drosha复合体的成分（图5b）。hnRNPA1在常见调控的选择性剪接事件中表现出与PRMT4、5和7类似的作用，进一步发现Arg-Gly-Gly（RGG）为hnRNPA1提供了与蛋白质和RNA结合的能力（图5c-e）。 找到六个RGG区域内的精氨酸残基，发现这些位点突变在不同程度上减弱了hnRNPA1 在选择性剪接调节中的功能，且突变体不能有效挽救hnRNPA1敲除引发的选择性剪接变化（图5f-g）。进一步研究发现PRMT7的敲低减弱了hnRNPA1与共调控基因的前体mRNA的结合。这表明精氨酸甲基化直接调节hnRNPA1与RNA的结合，而不是与其他剪接因子结合来调节选择性剪接。 PRMT表达和基因选择性剪接的改变与疾病的发生和进展有关，特别是在癌症中。在乳腺癌（BRCA）、结直肠癌（CRC）和前列腺癌（PC）中，PRMT4、5和7表达水平较高，且hnRNPA1 RGG结构域中的精氨酸甲基化通常显着高于正常样本（图6a-d），并能够观察到基因选择性剪接的变化，例如PPARA、SREBF2、RAB27B和WDPCP的变化（图6e-g）。 PRMT4、PRMT5、PRMT7或hnRNPA1的敲低能够导致癌细胞增殖速度减慢（图7a-d），并且与基因选择性剪接的变化相关（图7f，g），这一过程依赖于被PRMT4、5或7甲基化的精氨酸位点。总而言之，PRMT4、PRMT5、PRMT7 和hnRNPA1的精氨酸甲基化是多种类型癌细胞生长所必需的。 用EZM2302（PRMT4特异性抑制剂）、GSK591（PRMT5特异性抑制剂）及 SGC3027（PRMT7特异性抑制剂）分别或联合处理多种肿瘤细胞系，发现EZM2302显着降低MMA和ADMA水平；GSK591显着降低MMA和SDMA水平；SGC3027仅影响MMA水平。这些抑制剂皆对肿瘤细胞的生长起到抑制作用，共同处理表现出更高的抑制效果（图8）。 研究总结 PRMT4、PRMT5和PRMT7甲基化组共享一组与mRNA剪接有关的蛋白质，并共同调节一组选择性剪接事件。PRMT4、5和7介导下的剪接因子hnRNPA1的精氨酸甲基化参与与前 体mRNA的结合以及选择性剪接事件的调节。在乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌中，PRMT4、5和7表达上调，并与它们所调节的甲基化组（例如hnRNPA1）上的高水平精氨酸甲基化和异常基因选择性剪接相关，从而可能驱动癌细胞生长。 仅用于文献解读和分享，不作为商业使用。版权归文章原作者所有，若有侵权请联系删除