网络药理学＋生信标志物完美融合，干湿结合发文别太简单！

目前毕设也已经进入白热化的阶段，即将毕业的你是否做好准备了呢？如果还在发愁自己没有文章，那今天可看对眼了呢！这不，小记者给大家带来了中医药的新研究，网络药理学三部曲（交集靶点、ppi、GO/KEGG分析）引出研究内容，后再结合生物标志物以及湿实验直接拿下5.4分，还来不及做实验的你，就抓紧往下看，小记者罗列了下研究的主要方面，一起看看吧！

1）在本研究中，研究者利用LC-MS和HPLC分析鉴定了山苏叶的化学成分。2）然后利用小鼠模型确定了山杏叶乙醇提取物（EX）治疗HUA的有效剂量，并通过网络药理学初步探索了EX缓解HN进展的潜在信号通路。3）随后，进行了体内和体外实验，以验证EX在降低UA水平和保护肾脏方面的作用，同时探索其可能的机制。本研究为山苏叶片治疗HN的临床应用提供了基础科学信息。这一篇充分展现了生信作为工具发挥的作用，宝子们立马学起来~

• 题目：山嵛菜叶通过抑制PI3K/AKT信号通路来调节尿酸转运，从而缓解高尿酸血症肾病

• 杂志：JEthnopharmacol

• 影响因子：IF=5.4

• 发表时间：2024年3月

  
  

研究背景

高尿酸血症（HUA）是由尿酸（UA）分泌过多引起的代谢紊乱。它是一个复杂的生理过程，涉及肝脏、肠道、肾脏和其他器官。尿酸主要在肝脏中由次黄嘌呤产生，由黄嘌呤氧化酶（XOD）催化，是嘌呤代谢的最终产物。慢性肾功能衰竭在发展之前会伴随着血清UA水平的升高。在这种情况下，造成的肾脏损伤包括肾小管损伤、间质纤维化、肾小球硬化和尿酸盐结晶沉积，最终导致高尿酸血症肾病（HN）。因此研究HN的内在机制将有利于其预防和治疗。

数据来源

研究思路

建立了高尿酸血症小鼠模型，以初步评估山嵛菜叶(EX)的降尿酸作用并确定其有效剂量。使用超高效液相色谱法和液相色谱-质谱法进行了植物化学分析。利用网络药理学和生物信息学推断了EX缓解HN的潜在关键途径。然后建立HN大鼠模型，并进行了生物标志物检测、Western印迹、逆转录定量聚合酶链反应、免疫组化和Masson三色染色以及透射电子显微镜等实验，以评估EX对体外UA转运体表达的影响。

主要结果

1.EX处理对HUA小鼠SUA、CRE和BUN水平的影响

如图1A所示，与NC组相比HUA组的SUA含量显著增加。与NC组相比，SUA含量明显增加，这表明使用PO成功诱导了小鼠的HUA。EX治疗可有效降低HUA组小鼠血清CRE和BUN水平。

2.EX的特征

如图2所示，根据正负离子的相对保留时间和MS/MS数据，确定了EX中的41种化合物。模式下获得的相对保留时间和MS/MS数据。采用高效液相色谱法进行定量分析，发现EX中的槲皮苷和蛇床子苷含量分别为31.39%和31.39%（图3）。

3.网络药理学

使用Pharmaper平台对41种化学成分进行了靶标预测，并使用UniProt数据库进行了基因名称转换。经过整合和去重，确定了425个潜在靶点。通过绘制维恩图，确定了交叉靶标（图4A）。KEGG富集分析产生了212个KEGG条目。采用Cytoscape3.7.1软件进行可视化和分析，生成了一个由303个节点和5194条边组成的网络（图5）。将251个相互交叉的靶标输入STRING数据库以构建PPI网络（图7A），根据大于中位数两倍的度值筛选出核心目标（图6B）。

4.生物信息学    

在整理数据集以对芯片数据集进行质量控制后，对该数据集的数据进行了归一化处理，并生成了同质化图谱（图7A）。结果显示，GSE198133数据集中六个样本的中位数在同一条线上，表明该数据集质量可靠，可用于进一步的数据分析。采用主成分分析法将芯片数据集分为两组，即UA组和"健康对照组"（图7B和D）。从GSE198133中获得了17575个DEGs，其中上调9125个，下调8450个（图7E）。

利用GSE198133数据集的表达矩阵，WGCNA被用来构建网络。图8A显示了六个样本的聚类树；WGCNA使用了六个临床变量。构建了基因共表达网络TOM、dissTOM和基因共表达网络。进一步分析了分层聚类、热图和邻接关系（图8E、G）。利用网络药理学确定了25个突出基因，并将它们作为中心基因纳入研究。这些核心基因与GLUT9、URAT1和ABCG2结合在一起，发现它们在UA过量产生时异常表达。然后从三个WGCNA模块中提取了共同基因，如图9所示。

对这些不同的重叠基因进行了KEGG和GO分析。研究结果表明，这些基因可能在受影响细胞的增殖中发挥作用，影响体内的脂质代谢过程，参与线粒体和核膜，并表现出抗氧化活性（图10C）。基于这些发现进行了GSEA，图10D显示了结果。这些DEGs与信号通路有关，如血管内皮生长因子（VEGF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K-AKT，这与实验结果一致。

5.EX处理对HN大鼠SUA、CRE、BUN、肝脏XOD活性和KIM-1水平的影响

如图11A所示，与NC组相比，HN组大鼠体内的SUA水平显著增加。然而AP和EX处理都能明显降低SUA水平。血清KIM-1水平，表明EX治疗减轻了HUA引起的肾损伤程度（图11E）。

6.EX对HN大鼠肾脏中ABCG2、URAT1和GLUT9的影响

如图12所示，AP和EX治疗均逆转了HN大鼠肾脏中Urat1和Glut9表达的异常上调。AP和EX可逆转HN大鼠肾脏中URAT1和GLUT9表达的异常增加以及ABCG2的异常减少。免疫组化分析显示，AP和EX处理均显著降低了HN大鼠肾脏中GLUT9的阳性表达面积，显著增加了ABCG2的阳性表达面积。

7. EX处理对HN大鼠肾纤维化的影响

如图14A、B所示，Western印迹分析显示，AP和EX治疗均逆转了HN大鼠肾脏中胶原蛋白I、MMP9和MMP2水平的异常升高。免疫组化染色显示，AP和EX处理都显著减少了HN大鼠肾脏中胶原蛋白I和MMP2的阳性表达区域（图14C和D）。TEM图像 (图14F）显示，细胞形态完好，细胞核清晰。在EX组中，肾小管上皮细胞形态完整，膜轻微脱落，线粒体轻微膨胀。与HN组相比线粒体形态明显改善。干预后线粒体形态明显改善，这表明HN大鼠肾小管上皮细胞的线粒体平衡得以维持。

8. EX对HN大鼠肾脏PI3K/AKT信号通路的影响

如图15所示，与NC组相比，HN组肾脏中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著升高。然而，AP和EX然而，AP和EX处理都能明显降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表达。

9.服用槲皮素和仙鹤草苷对UA诱导的HK-2细胞URAT1和GLUT9蛋白表达水平的影响

为了建立HK-2细胞损伤模型，用UA处理细胞。如图16A和B所示，测试了不同浓度的UA。结果表明UA介导的HK-2细胞损伤模型已成功建立。然后测定了槲皮素和塞那苷对UA诱导的HK-2细胞损伤的影响。结果显示浓度为12.5和6.25μM时，服用槲皮素和塞那苷可逆转GLUT9表达的异常增加。

文章小结

网络药理学和生物信息学分析表明，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路是EX缓解HN进展的关键通路。EX能降低HN大鼠血清中的生物标志物，并上调ATP结合盒G亚家族成员2（ABCG2）的表达，从而改善HN大鼠肾间质纤维化。在EX中发现了高含量的槲皮素和槲皮苷，服用它们可抑制受损HK-2细胞中GLUT9和URAT1的表达。看到这里是否有些启发呢？这个研究巧妙地结合了网络药理学和体外实验，深入的探讨了EX对HN的作用，不仅为治疗提供新的可能，而且也给我们提供了思路呀，这种干湿结合的方法很容易复现，况且还是网络药理学呢，简单好上手。